海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化菌對造紙廢水降酚性能的研究

實驗使用的苯酚降解菌株為革蘭氏陰性短粗桿菌Klebsiella pneumoniae ZS01，來自于本實驗室（-80℃超低溫冷凍儲存冰箱）。

（1）菌株在pH值為7的MPYE培養基中進行富集，每升培養基中含有3 g魚粉蛋白胨，3 g酵母膏，1 g CaCl₂·2H₂O，1.6 g MgCl₂，在恒溫搖床中以150 r/min的轉速在35℃下進行培養。菌株生長24 h后，在4℃下以 8000 r/min 的轉速離心5 min去除上清液來收集細菌。用無菌水通過紫外可見分光光度計在600 nm下將細菌濃度調整到0.8，用于細菌固定化。

（2）在苯酚降解過程中，富集菌株在35℃的MedA培養基中生長，每升培養基中含有：2 mL質量分數2%天冬氨酸、20 mL pH值為6.8的Solution C溶液（10 g氮川三乙酸，3.33 g CaCl₂，29.5 g MgSO₄·7H₂O，93 mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，99 mg FeSO₄·7H₂O，50 mL微量元素溶液）、1.25 g L-谷氨酸、10 mL質量分數10% NaCl。培養基用1 mol /L KOH和1 mol /L HCl溶液將其pH值調至7.0~7.3后120℃高溫滅菌30 min，然后用微孔濾膜加入10 mL維生素溶液、20 mL磷酸鹽緩沖溶液（將KH₂PO₄溶液加入到K₂HPO₄溶液中至pH值為6.8）。

（3）苯酚原液的配制：取一定量的苯酚將其配制成6 g/100 mL的苯酚原液并置于4℃冰箱中保存備用。

蒙脫土（240 m²/g）、海藻酸鈉、瓊脂和苯酚試劑均購自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他化學品均為分析純或色譜純；所有培養基和實驗材料均預先在120℃下高壓滅菌。

將蒙脫土和瓊脂溶解在去離子水中，混合分散加熱至100℃后，加入海藻酸鈉，不斷加熱攪拌30 min，至水凝膠混合均勻，并且確保水凝膠不含氣泡。混合均勻的水凝膠溶液在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌30 min，將富集菌株加入至滅菌后冷卻的水凝膠溶液（約40℃）中并充分混合均勻。通過注射器將均質水凝膠溶液滴入滅菌的CaCl₂（4% 質量/體積）中，制備直徑約3 mm、質量約50 mg的水凝膠珠，于4℃冰箱中固定化12 h。固定的水凝膠珠用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=7.2）至少洗滌3次以去除微球上殘留的鈣離子，制得海藻酸鈉-蒙脫土-瓊脂固定化微球。制備的固定化微球儲存在4℃中以備后用。

為更好地研究固定化微球的降解效果，首先探究了影響固定化微球生物降解苯酚性能的4個因素。根據前期預實驗結果，在進行單因素實驗時，對不同影響因素采用一定遞增比例的濃度進行批量實驗。將不同濃度的固定化微球和滅菌苯酚加入裝有100 mL滅菌MedA培養基的250 mL錐形瓶中，使苯酚濃度達到1000 mg/L。將所有燒瓶用滅菌封口膜密封以防止苯酚氧化，然后置于35℃、150 r/min的恒溫培養箱中降解。定期收集樣品，并測量殘留苯酚濃度。

在上述最佳條件下，還研究了固定化微球在苯酚作為唯一碳源時，苯酚降解性能最優時的苯酚初始濃度。在不同苯酚初始濃度（200、400、600、800、1000 mg/L）條件下，接種相同濃度的游離細菌作為對比實驗，將它們與固定化微球的降酚性能進行比較。定期收集樣品測量苯酚的殘留濃度。苯酚降解數據用于計算苯酚降解的比降解速率和降解動力學分析。

圖1(a)為海藻酸鈉微球的表面直觀圖，由圖1(a)可以看出，海藻酸鈉具有很好的成球性，呈透明白色狀。圖1(b)為固定化微球的表面直觀圖，復合瓊脂和蒙脫土后，微球變為不透明乳白色，形狀規則，球體大小均勻。圖1(c)為固定化微球重復使用5次后的外觀圖，經5次循環后，微球外觀已變成黃色，這是因為微球內部繁殖生長出大量的細菌細胞，且實驗室細菌為黃色，因此固定化微球也變成黃色。

圖1  不同材料的形態

Fig. 1  Appearance of different materials

圖2(a)~圖2(d)為游離細菌、不同固定材料及固定化微球的橫截面形貌圖。由圖2(a)可以看出，海藻酸鈉微球內部包含不規則的交聯網絡結構，結構類似于先前研究得出的結論^[15]。由圖2(b)可以看出，此時海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土微球內部變成了更為緊湊的片狀網絡結構。可見瓊脂和蒙脫土與海藻酸鈉交聯后，微球內部孔隙增多，一方面為細菌的附著和固定提供了更大的比表面積，另一方面也增加了底物的傳質效率，也有利于營養物質的傳輸和新陳代謝產物的排出。對比游離細菌（圖2(c)）的形貌圖，說明固定化微球（圖2(d)）內部有大量細菌成功附著。

  

  

  

  

圖2 不同固定材料及其固定化微球的ESEM圖

Fig. 2 ESEM images of different immobilized materials and immobilized microphere

本研究將海藻酸鈉滴入質量分數4% CaCl₂溶液中形成凝膠微球，研究了不同海藻酸鈉質量分數對苯酚降解的影響。圖3(a)為海藻酸鈉質量分數對苯酚降解速率的影響。由圖3(a)可知，海藻酸鈉質量分數為1%的固定化微球苯酚達到最大降解速率（18.18 mg/（L·h））。隨著海藻酸鈉質量分數的增加，交聯網絡結構增多，固定化微球內部比表面積增大，為微生物提供了足夠的吸附、生長、繁殖的空間，從而提高了微生物傳質效率。海藻酸鈉質量分數增加至1.5%時，導致固定化微球的苯酚降解速率下降（15.87 mg/（L·h）），說明高質量分數海藻酸鈉會使固定化微球內部過飽和，阻礙底物分子通過微球內部擴散，降低細菌對苯酚的降解速率^[16]。綜上，制備固定化微球海藻酸鈉的最佳質量分數為1.0%。

  

  

  

  

圖3 影響苯酚降解速率的因素

Fig. 3 Factors affecting the degradation rate of phenol

不同蒙脫土質量分數對苯酚降解的影響結果見圖3(b)。由圖3(b)可知，當蒙脫土質量分數從0增加到1.0%時，苯酚降解速率緩慢增加。當蒙脫土質量分數為1.5%時，苯酚降解速率達最大值17.85 mg/（L·h）。這是因為蒙脫土可以吸收少量苯酚，減輕苯酚對細胞的毒性，為細菌生存創造良好的微環境。在固定化微球中加入蒙脫土可以提高其機械強度、滲透性^[15]。但當蒙脫土質量分數增加至2.0%時，苯酚降解速率與低質量分數蒙脫土苯酚降解速率相當，約（16 mg/（L·h）），這可能是由于固定化微球中高質量分數的蒙脫土堵塞了微球的內部孔隙，阻礙了細菌的生長和底物的擴散，從而抑制了降解細菌的活性。綜合考慮，固定化微球中蒙脫土的最佳質量分數為1.5%。

瓊脂質量分數對固定化微球降解苯酚性能的影響如圖3(c)所示。由于瓊脂質量分數增高（0.5%、1.0%），固定化微球的片狀網絡結構增加，固定化微球內部平均孔徑增加，機械強度和穩定性也隨之增加，固定化細菌的數量也隨之增加，細菌降解苯酚的速率進一步提高，這一結果在Rehman等人^[17]的研究中也有體現。當瓊脂質量分數過高時（2.0%），固定化微球內部變得更為致密，導致內部孔徑減小，也影響了底物擴散到固定化微球內部的速度，從而降低了苯酚的降解效率。因此，制備固定化微球的最佳瓊脂質量分數為1%。

不同包埋細菌濃度（體積分數10%~30%）(OD₆₀₀為0.8)對苯酚降解速率的影響結果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知，隨著細菌接種量的增加，苯酚的降解速率逐漸增加。細菌接種量從20%增加至25%時，苯酚降解速率迅速增加到18 mg/（L·h），這是因為細菌細胞對高濃度苯酚的適應性逐漸增強，導致細菌細胞增殖更快，生物降解效率更高。當接種量升高至30%時，降解速率并未顯著提高，大量細菌在微球內部迅速繁殖導致微球過飽和，此時不僅影響微球的機械穩定性，也會導致細菌從微球泄露到溶液中，影響后續循環降解實驗^[18]。綜合上述因素，制備固定化微球的最佳細菌接種量為25%。

根據單因素實驗結果，采用正交實驗考察影響固定化微球各因素之間的交互作用，從而確定最優的細菌固定化條件，正交因素水平如表1所示。

K_i值表示該列因素水平為i時所對應的實驗結果總和，可以判斷某個因素的最優水平和最優組合；R值表示某個因素水平的極差，反應某個因素水平波動時，實驗結果的變動幅度，R值越大，該因素對實驗結果的影響越大，可以判斷因素的主次順序。以固定化微球對苯酚的降解速率為考察指標，正交實驗結果如表2所示。由表2可知，影響固定化微球對苯酚降解速率因素的主次順序為：海藻酸鈉質量分數＞細菌接種量＞瓊脂質量分數＞蒙脫土質量分數。正交實驗得出制備固定化微球的最優組合為：海藻酸鈉質量分數1.0%，蒙脫土質量分數1.5%，瓊脂質量分數1.0%，細菌接種量25%。在最優固定化條件下制備固定化微球，固定化微球可在60 h內完全降解1000 mg/L的苯酚，苯酚降解速率為16.67 mg/(L·h)。

重復使用性是固定化微球的一個重要考察指標，循環周期中固定化微球苯酚降解速率和細胞活性見圖7。如圖7(a)所示，在前6個循環中苯酚降解速率迅速增加，苯酚降解速率從16.67 mg/（L·h）增加到45.45 mg/（L·h），此時固定化微球降酚效率處于穩定期，降解時間維持在22 h。由圖7(b)可知，設定初始細菌活性為100%，相對活性以其初始活性的百分比表示，循環周期中固定化微球的相對活性與苯酚降解速率的趨勢是一致的，重復培養時細菌分泌大量胞外聚合物，形成了生物膜，為重復苯酚降解提供適當的環境^[19]。后期降解效率略微下降，這可能是因為固定化微球中細菌生物質的最大量，限制了底物轉移到微球內部中。實驗過程中觀察發現，珠粒的形態基本保持完整的形態，直到32次循環結束，珠子結構完全被破壞，循環終止。

圖7  循環周期中固定化微球的苯酚降解速率與細菌活性

Fig. 7  Degradation rate and cell viability of immobilized micropheres in the cycle

固定化微球的儲存穩定性是其是否能被工業化大規模應用的重要考量因素之一。圖8為固定化微球和游離細菌的儲存穩定性。如圖8所示，隨著儲存時間的延長，固定化微球保持穩定的苯酚降解率，在4℃下儲存30天后依然可以去除99%的苯酚。微球內的細菌保持生理穩定性且微球具有較高的機械強度。相比之下，游離細菌的苯酚降解率在超過15天后急劇下降，甚至在30天后失去活性。以上結果表明固定化微球具有很強的儲存穩定性，可以重復使用，在實際應用中具有巨大的潛力。

圖8  固定化微球和游離細菌的儲存穩定性

Fig. 8  Storage stability of immobilized micropheres and free bacteria