低產高級醇工業上面發酵酵母的選育

啤酒是以酒花和麥芽汁為原料,由啤酒酵母釀制而成的酒精飲料[1]。酵母代謝產生的風味物質決定了啤酒的感官特性。根據風味物質的化學屬性,可將其分為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類、內酯類化合物、縮醛類化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物、芳香族化合物、硫化物等[2-3]。其中,高級醇是指3個或3個以上碳原子的醇類的統稱,同時也稱為雜醇油[1],是啤酒中重要的風味物質,主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、苯乙醇[4-5]。

啤酒中高級醇的含量一般為70～100 mg/L,而優質啤酒對高級醇含量的控制更為嚴格,通常在50～90 mg/L [6]。適量的高級醇能賦予啤酒獨特的香味,含量過低,酒體不豐滿,口感較差;但含量過高時,不僅會影響酒體的協調性,還會對飲用者的身體產生明顯的副作用[7-9]。啤酒高級醇含量過高是業內普遍存在的問題,如何將高級醇含量控制在合理范圍對于提升啤酒品質具有重要的意義。目前,高級醇的調控主要有兩種手段：一是通過原輔料、發酵溫度、溶氧量等指標調控來優化發酵工藝；二是從發酵菌種出發,通過選育低產高級醇的優良酵母菌株從根本上降低高級醇含量。

近年來,隨著對誘變技術的深入研究,由清華大學邢新會研究團隊自主研發的常壓和室溫等離子(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變技術已經成為了一種新型的育種方法。與傳統的誘變技術相比,此項技術具有操作簡便、安全性高、高通量誘變、高總突變率和正向突變率高的特點[10],已經廣泛應用于細菌、真菌、微藻等多種微生物的改造[11-15]。

篩選過程是選育低產高級醇酵母菌株的關鍵限速步驟。傳統的搖瓶發酵篩選方法雖然準確度較高,但操作繁瑣、周期長、工作量大,無法做到菌株的快速篩選[16]。近年來,高通量篩選得到了快速發展。研究表明,分光光度法可以實現高級醇含量的快速檢測[17]。此外,微孔板的高通量篩選技術在菌株篩選方面也取得了良好的效果,提高了篩選效率[18-19]。這些均為低產高級醇酵母菌株的高通量篩選提供了新的策略。

本研究以工業酵母(Saccharomyces cerevisiae)680bg為出發菌株,利用ARTP誘變技術對其菌懸液進行處理,運用微孔板培養法結合分光光度法,建立高通量篩選方法,以期篩選低產高級醇菌株,為啤酒酵母的選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

Saccharomyces cerevisiae 680bg,德國專用小麥啤酒上面酵母,由某啤酒公司提供。

1.1.2 主要試劑

酵母浸粉,北京奧博星生物技術有限公司；胰蛋白胨,天津市英博生化試劑有限公司；葡萄糖,分析純,天津市永大化學試劑開發中心；瓊脂粉、瓊脂糖,Solarbio公司；NaCl、亞鐵氰化鉀,均為分析純,天津市北方化玻購銷中心；H2SO4,天津市化學試劑一廠；dNTP,TaKaRa公司；PEG3350,分析純,北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉,分析純,天津市北方天醫化學試劑廠；正丙醇標準品、異丁醇標準品、2-苯乙醇標準品,均為色譜純,天津聯星化工有限公司；CuSO4,天津市化學試劑六廠；對二甲氨基苯甲醛,分析純,天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3 主要儀器

T gL-16C臺式離心機,上海安亭科技儀器廠；UVmini-1240紫外分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司；gL20A型高速冷凍離心機,中科院生物物理所技術服務公司；ARTP-II型ARTP等離子體誘變儀,北京思清源生物科技有限公司；全自動生長曲線分析儀,芬蘭BIOSCREEN公司；7890A氣相色譜儀,美國安捷倫科技公司。

1.1.4 主要培養基

(1)YEPD培養基:2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母浸粉,pH自然,115 ℃滅菌20 min。固體培養基需在此基礎上再添加2%瓊脂粉。

(2)LB培養基:1%蛋白胨,1%NaCl,0.5%酵母浸粉,pH自然,115 ℃滅菌20 min。固體培養基需在此基礎上再添加2%瓊脂粉。

(3)麥芽汁培養基:由某啤酒公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 680bg菌株生長曲線的繪制

從斜面上挑取菌種1環接種到裝有5 mL YEPD液體培養基的試管中,30 ℃條件下靜置培養過夜。按2%～5%接種量接種,在培養溫度為30 ℃,600 nm下用全自動生長曲線分析儀測定菌株的吸光值,期間每隔1 h測定菌液的OD600值。以培養時間為橫坐標,OD600值為縱坐標,繪制菌株的生長曲線。

1.2.2 啤酒發酵工藝

取斜面菌種1環接種于盛有50 mL麥芽汁培養基(麥汁濃度為12 °P)的三角瓶中(250 mL),25 ℃培養36 h。將種子液在6 500 r/min的條件下離心3 min,棄上清液,以25 mL的無菌水洗滌2次。按照100 g/L的接種量接種于裝有150 mL麥汁(麥汁濃度為12 oP)的250 mL三角瓶中,16 ℃靜置發酵7 d。

1.2.3 ARTP誘變條件的確定

取培養至對數中期的菌液離心,棄上清液,用無菌生理鹽水將其稀釋成OD600值在0.6～0.8的菌懸液。準確吸取10 μL菌液均勻的涂于無菌金屬載片表面后立即進行ARTP誘變處理。調節各項參數,使載片與放射源之間距離為2.5 mm、儀器功率為100 W、氣流量參數為10 SLM。分別從0、10、20、25、30、35、40、45 min開始處理樣品。誘變后,將載片轉移至裝有1 mL生理鹽水的1.5 mL的EP管中,振蕩2 min。取適量菌懸液涂布于初篩平板上,30 ℃倒置培養48 h。觀察菌株生長情況,計算菌落數與致死率。最后以誘變時間為橫坐標、誘變時間對應的致死率為縱坐標繪制致死曲線。

1.2.4 高通量篩選方法的建立

為了從大批誘變菌株中快速高效地篩選出低產高級醇工業酵母菌株,建立了分光光度法結合48孔板發酵的高通量篩選方法。將誘變處理后的菌懸液稀釋涂布于YEPD固體平板上,30 ℃培養36 h。挑選單菌落于新的YEPD平板上,30 ℃繼續培養24 h。用干凈的槍頭將誘變菌株挑入裝有1 mL麥汁的48孔板中,16 ℃連續發酵適當時間后離心取上清液稀釋。在比色管中加入1.2 mL稀釋后的上清液,置于冰水浴中,沿管壁緩慢的加入0.8 mL 0.5%的對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液,輕輕晃動各管使反應液混勻,沸水浴15 min,冷卻備用。將反應液加到96孔透明酶標板中,在520 nm下測其吸光度。

1.2.5 突變株的復篩驗證

運用高通量篩選方法雖然可以快速地篩選出高級醇含量降低的菌株,但是準確性較差,為了提高實驗的精確度,還需將初篩菌株搖瓶發酵后利用氣相色譜技術進行復篩驗證。將初篩菌株與出發菌株680bg按小麥啤酒發酵工藝條件進行250 mL體系的三角瓶發酵,發酵結束后檢測發酵液的高級醇含量、酒精度、發酵度等重要指標。選擇高級醇含量顯著降低,其他生理指標不變的菌株繼續發酵3輪,最后將高級醇含量降低、各項生理指標不變且遺傳性能穩定的菌株定為篩選出來的優良菌株。

1.2.6 發酵性能分析

通過CO2排放量的測定來監測整個發酵過程,每隔12 h稱重1次,當12 h失重≤0.1 g時,表明發酵已經結束。測定發酵液殘糖含量、酒精度以及真正發酵度。發酵液蒸餾后采用氣相色譜儀檢測高級醇含量。

檢測條件：FID檢測器,毛細管色譜柱HP-INNOWAX(50 m×320 μm×1.0 μm)載氣為純度為99.99%的高純氮氣,分流比1∶10。進樣口溫度200 ℃,檢測器溫度200 ℃,進樣量1 μL。采用程序升溫,50 ℃保持8 min,5 ℃/min升溫,升溫至180 ℃,保持15 min,每個樣品處理時間43 min,為保持數據的準確性,每個樣品進樣2次,取平均值。

1.2.7 誘變菌株遺傳穩定性能分析

將活化的誘變菌株于種子培養基中進行連續8次傳代培養,再通過搖瓶發酵檢驗每代突變菌株產高級醇能力及各項基本性能的穩定性。

2 結果與分析

2.1 680bg菌株生長曲線的繪制

一般選擇處于對數中期的菌株進行ARTP離子誘變,為了確定菌株680bg對數中期,依照方法1.2.1測定并繪制了680bg的生長曲線。結果如圖1所示,酵母菌株680bg在培養5.5 h時處于對數中期,所以選取培養5.5 h的酵母細胞進行誘變處理。

圖1 出發菌株680bg的生長曲線

Fig.1 The growth curve of original strain 680bg

2.2 ARTP誘變致死曲線的繪制

據報道,誘變的致死率約為80%～85%時,誘變效果較好。因此,依據方法1.2.3,對出發菌株680bg進行誘變處理,并繪制致死率曲線,結果如圖2所示。出發菌株680bg的致死率隨照射時間的延長而逐步增大,當誘變時間為35 s時酵母菌株的致死率為81%,誘變50 s時菌株已經全部死亡。因此,選取35 s作為后續處理的誘變時間。

圖2 出發菌株680bg的致死率曲線

Fig.2 The lethal rate curve of original strain 680bg

2.3 誘變菌株的初篩

目前高級醇的檢測方法主要包括比色法和氣相色譜法[20],其中氣相色譜法可以準確地測量出高級醇含量,但是操作起來較為繁瑣,耗時耗力,不適合初篩工作。比色法操作簡單方便,雖不能準確測量出高級醇具體數值,但卻能粗略地評價高級醇(主要是異丁醇與異戊醇)含量。前期研究表明,出發菌株680bg代謝生成的高級醇主要是異丁醇和異戊醇。因此,本研究利用比色法對菌株進行初篩選,而后利用氣相色譜法對菌株進行復篩驗證。

2.3.1 誘變菌株初篩方法的建立

高級醇經濃硫酸脫水后轉化的不飽和烴可與對二甲氨基苯甲醛發生縮合反應生成橙黃色化合物,該產物在520 nm處有最大吸收值,且含量與吸收值符合朗伯-比爾定律[17]。為了確定發酵液中的高級醇含量與其在520 nm處吸光值相關性,以發酵液中高級醇濃度為橫坐標,520 nm處吸光值為縱坐標繪制了標準曲線,并且得出吸光值與高級醇之間關系式為y=0.002 6x-0.007 6。由此可知,發酵液中的高級醇濃度與其在波長520 nm處吸光值之間存在正相關性。然而,該標準曲線的R2僅為0.986 65,不能準確反應高級醇的含量。因此,該方法只適用于菌株的初步篩選。

2.3.2 誘變菌株培養時間的確定

為了測定誘變菌株在48孔板中的最優培養時間,將出發菌株分別培養12、24、36、48、60、72、84 h后,按1.2.4介紹的方法測量其在各個時間點產生高級醇所對應的OD520值。由圖3可知,在培養12～48 h期間,菌株代謝產生的高級醇含量急劇增加,在培養60 h后高級醇生成速率變慢,直到72 h時,高級醇含量趨于穩定,不再增加。因此,選取72 h作為后續實驗的培養時間。

圖3 出發菌株680bg在不同培養時間下高級醇的生成量(OD520)

Fig.3 The higher alcohols production(OD520)of original strain 680bg at different cultivation times

2.3.3 誘變菌株初篩結果

將出發菌株與誘變菌株培養72 h后,依照方法1.2.4所描述的內容對其進行比色法處理,以誘變菌株為橫坐標,其所對應的OD520值與出發菌株OD520值的比值為縱坐標繪制了如圖4所示的柱狀圖,將比值在0.4～0.65的菌株初步認定為低產高級醇的菌株,共篩選得到51株誘變菌株。

a-初篩菌株；b-初篩菌株

圖4 低產高級醇菌株的初篩

Fig.4 Preliminary screening for strains with lower yield of high alcohol

2.4 誘變菌株復篩

由于比色法只能粗略地檢測高級醇的含量,且此法受溫度等因素的影響較大,難免會產生一定的偏差,為了更加精確地篩選出低產高級醇菌株,需要對51株初篩菌株與出發菌株680bg進行發酵驗證。

2.4.1 高級醇含量比較

采用1.2.2介紹的發酵工藝培養菌株7 d,取發酵液離心、蒸餾,用氣相色譜技術檢測誘變菌株與出發菌株高級醇含量。結果如表1所示,經過誘變、反復篩選,共得到了8株低產高級醇菌株,其中,ARTP-162菌株產生的高級醇含量是所有菌株中最低的,與出發菌株相比降低了約21%,其他的誘變菌株(ARTP-5、ARTP-12、ARTP-32、ARTP-65、ARTP-109、ARTP-113、ARTP-129)的高級醇含量也較出發菌株分別降低了14.3%、12%、11.25%、9.9%、12.1%、12.8%、11.1%。

表1 誘變菌株與出發菌株高級醇含量 單位：mg/L

Table 1 Comparison of higher alcohol contents between mutated strain and the original strain

2.4.2 基本理化指標比較

待發酵結束后,對所有菌株的酒精度、真正發酵度及發酵力等理化指標進行測定、分析。如表2所示,與出發菌株680bg相比,誘變菌株無論是在CO2釋放量、酒精度還是真正發酵度上,均沒有發生明顯的變化。這意味著這些誘變菌株不僅具有低產高級醇的特性還保留了良好的發酵性能。

表2 出發菌株680bg及誘變菌株的基本發酵性能

Table 2 Fermentation performances of original strain 680bg and mutated strain

2.5 誘變菌株遺產穩定性檢測

通過連續傳代實驗,對菌株ARTP-162的遺傳穩定性進行了分析。如圖5所示,隨著傳代次數的增加,誘變菌株ARTP-162的產高級醇能力、酒精度、真正發酵度及CO2生成量等基本發酵性能并沒有發生大變化,直至第八代也基本維持穩定,這表明誘變菌株ARTP-162遺傳性能穩定,可用于工業化生產。

a-傳代次數對菌株高級醇產量的影響；b-傳代次數對菌株酒度、發酵度及總失重的影響

圖5 誘變菌株的遺傳穩定性分析

Fig.5 Analysis of genetic stability of mutagenic strain

3 結論

ARTP離子誘變是一種新型有效的誘變育種方法。本研究以菌株680bg為出發菌株,運用ARTP離子誘變手段對其進行誘變處理,經48孔板培養后用高級醇分光光度法快速檢測菌株的高級醇含量,建立了完整有效的高通量篩選方法。經過兩輪篩選,共得到了8株低產高級醇誘變菌株,其中誘變菌株ARTP-162降低效果最為顯著,大約降低了21%,且遺傳性能穩定。該方法的建立為低產高級醇菌株的選育提供了新的策略。