鑒定紅曲菌中萘醌響應基因提高紅曲色素產率

紅曲色素是由紅曲菌(也稱紅曲霉)(Monascus spp.)合成的一類次級代謝產物[1-2],作為天然食用色素,在我國以及東南亞地區使用至今已有1 000多年歷史[3]。近年來,紅曲色素以其著色自然、健康無毒以及色調溫和等特點,成為國內銷量較高的天然食用色素之一,并出口到歐美等發達國家[4]。

目前紅曲色素生產菌株的產率仍不能完全滿足工業生產需要。因此,提高紅曲菌產率仍是本領域中的核心課題[5-6]。前期研究發現,萘醌化合物能夠促進紅曲菌合成紅曲色素[7]，如果能夠找到紅曲菌中響應萘醌化合物的基因,將有可能利用萘醌化合物提高紅曲色素產率。然而,目前紅曲菌的萘醌響應基因仍未見報道[7]。

隨著轉錄組學與人工智能的發展,已有報道可以借助這2種工具來挖掘目標基因[8-9]。人工智能是一種利用不同計算機算法來進行數據學習,得到描述生物等過程模型的預測方法[10]。近年來發展起來的人工神經網絡(artificial neural network,ANN)模型,能夠較為精確地描繪微生物中基因與表型之間的內在關系,用于挖掘參與特定生物過程的關鍵基因[8-10]。

本研究首先利用轉錄組方法初步篩選了M.ruber M7菌株中參與萘醌響應的基因,然后選擇并優化得到ANN模型,借此預測出2個可能性最高的萘醌響應基因,利用基因敲除菌株驗證mga2基因是萘醌響應基因,以期利用白花丹醌誘導mga2基因過表達菌株獲得較高的紅曲色素產率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Monascus ruber M7(CCAM 070120,Culture Collection of State Key Laboratory of Agricultural Microbiology)為本實驗保存。紅曲菌基因敲除菌株ΔlaeA、ΔmrpigB和Δmga2,以及mga2基因過表達菌株M7::PtrpC-mga2為本課題組前期構建并保存。萘醌類化合物1,4-萘醌、甲萘醌、1,2-萘醌、白花丹醌、5-羥基-1,4-萘醌與拉帕醇,上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1700型分光光度計,日本Shimadzu公司；LC-20AT高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 M.ruber M7的生物量測定

將M.ruber M7接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)斜面培養基上,在28 ℃條件下培養10 d,用無菌水洗滌斜面菌絲上的孢子,得到5×105 孢子/mL的孢子液。將5 mL孢子液接種到50 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養基中,在28 ℃,120 r/min的條件下培養。發酵第12天時,離心(5 000 r/min)分離菌絲體和發酵液,冷凍干燥后稱量菌絲體干質量。

1.3.2 萘醌化合物誘導發酵實驗

將萘醌化合物預先溶解于二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)。在液態發酵第5天時,將萘醌溶液加入發酵液中,繼續培養。

1.3.3 紅曲色素的測定

取冷凍干燥的菌絲體0.1 g,研磨成細粉后加入5 mL甲醇溶液(體積分數為80%),于60 ℃條件下提取胞內紅曲色素1 h,12 000 r/min離心5 min,棄去沉淀收集上清液。上清液用甲醇溶液(體積分數為80%)稀釋到適當倍數,分別測定上清液在380、470、520 nm處的吸光度值,分別計算菌絲體中黃、橙、紅色素的色價,總色價為三者之和[11]。色價計算如公式(1)所示：

色價=A×總稀釋倍數

(1)

式中：A為特定波長的吸光度值。

1.3.4 紅曲菌總RNA的提取和轉錄組測序

選取受萘醌化合物誘導的M.ruber M7為樣本,以未誘導的M.ruber M7為空白對照。采用Trizol法提取M.ruber M7的總RNA,檢測RNA的OD260/OD280在1.8～2.2,確保總RNA質量,然后利用Agilent 2100生物分析儀驗證RNA樣品的完整性。由微浪生物科技有限公司進行cDNA文庫的構建及高通量測序,得到轉錄組數據。

基因mga2的相對轉錄水平按前期所建立的實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRTPCR)方法測定[7]。

1.3.5 轉錄組分析與萘醌響應基因預測

首先根據reads長度、paired-end關系、質量值等,采用FPKM法估算基因表達水平,然后對read count進行標準化,再進行假設檢驗概率計算,最后進行多重假設檢驗校正。對不同萘醌類化合物處理的紅曲菌樣品,分析各樣品中的轉錄組數據,當同一個基因的表達量在不同樣品間顯示出差異時,如果其假陽性率<0.05,且差異倍數>3,則認為該基因在不同樣品中具有顯著差異表達。

1.3.6 人工智能預測萘醌響應基因

將萘醌響應基因及其對應樣本的紅曲色素產量信息,分別定義為輸入變量。采用Auto-sklearn軟件[12],建立線性模型(linear models)、偏最小二乘回歸(partial least squares regression model,PLSR)、彈性網絡模型(elastic net model)、隨機森林模型(random forest model)、ANN模型這5種預測模型[13]。

為了提高ANN的預測精度并降低計算量,通過篩選激活函數和優化器對ANN進行優化,并計算和校驗ANN的預測準確率[14]。利用優化后的ANN預測得到萘醌響應基因,如果這些基因的貢獻率>95%,則認為這些基因即為萘醌響應基因。

2 結果與分析

2.1 萘醌化合物提高紅曲色素產率

選擇6種萘醌化合物,以不同濃度(10、30或50 μmol/L)分別添加到培養5 d的M.ruber M7培養物中。1,4-萘醌、甲萘醌、白花丹醌和拉帕醇這4種萘醌能夠顯著提高紅曲色素產率。其中,30 μmol/L的白花丹醌效果最明顯,紅曲色素產率從1 131 U/mg增加到1 436 U/mg(圖1)。HU等[15]也發現萘醌化合物在低濃度下能促進M.ruber M7合成紅曲色素。結果證明萘醌化合物能夠促進紅曲色素合成,也說明紅曲菌中可能存在萘醌響應基因。

a-10 μmol/L萘醌化合物；b-30 μmol/L萘醌化合物；c-50 μmol/L萘醌化合物

圖1 添加外源萘醌化合物提高M.ruber M7的紅曲色素產率

Fig.1 Improvement of Monascus pigments yield by exogenous naphthoquinone

2.2 轉錄組學與人工智能模型聯用預測萘醌響應基因

分別測定了1,4-萘醌、甲萘醌、白花丹醌和拉帕醇在不同濃度條件(10、30或50 μmol/L)處理M.ruber M7的轉錄組數據和紅曲色素產率數據。采用PLS-DA對基因轉錄表達數據進行分析,共得到20個差異基因(表1)。其中,17個基因涉及細胞內的信號傳導途徑,其余3個基因分別涉及萘醌降解途徑[16]、麥角固醇合成途徑[17]以及紅曲色素合成途徑[18]。

表1 轉錄組學方法預測的萘醌響應基因

Table 1 Naphthoquinone-responsive genes predicted by transcriptomics analysis

注：“↑”代表基因表達水平提高3倍以上;“↓”代表基因表達水平降低1/3以上。樣品:a,14 NQ;b,menadione;c,plumbagin;d,lapachol

為了縮小萘醌響應基因的范圍,利用紅曲色素產率和差異表達基因的數據,分別對Linear、PLSR、Elastic Net、Random forest和ANN這5種人工智能模型進行了訓練。平均交叉驗證系數(R2)通常被認為是判斷模型的預測值和實測值之間相關性的重要指標,而擬合標準差(root mean square error,RMSE)是反映模型預測值與實際測量值之間平均差距的關鍵參數。比較5種模型,發現ANN的R2最高,而RMSE最低(圖2-a和圖2-b),說明ANN能夠更好地預測M.ruber M7的萘醌響應過程。目前人工智能模型中,ANN也被認為是預測生物體內復雜過程的重要工具[19]。

盡管ANN在這些模型中較優,但該ANN模型的預測精度僅有0.72。為進一步優化該模型(圖2-d),采用激活函數來提高預測精度和降低計算量[20]。本研究嘗試了3種激活函數,其中LReLu表現最好,使ANN預測精度提高到0.81(圖2-d)。但此時ANN仍需要較高的訓練步數(>25 000步)。進一步采用優化器Adam降低轉錄組數據中的噪聲以提高擬合水平[21],結果表明訓練步數僅需要6 000步就能夠將精度提高至0.87(圖2-e)。

a-不同模型的平均交叉驗證系數R2；b-不同模型的擬合標準差RMSE；c-ANN模型計算過程示意圖；d-激活函數對ANN模型預測精度的影響；e-優化器對ANN模型預測精度與計算步數的影響

圖2 人工智能模型的篩選以及ANN模型的優化

Fig.2 Selection and optimization of ANN model

利用優化后的ANN模型進一步從20個基因中預測出4個萘醌響應基因：laeA、mga2、artR和sk。laeA和mga2在4種萘醌類化合物條件下都被ANN模型預測為萘醌響應基因。而artR和sk這2個基因卻僅在一定條件下被作為萘醌響應基因(表2)。基因artR在絲狀真菌中調控麥角固醇的生物合成[22]。基因sk是鞘磷脂生物合成途徑中的關鍵基因,可能涉及細胞生長和發育[23]。因此artR和sk也可能參與了M.ruber M7的萘醌響應過程,但需要一定的條件才能有明顯表現。因此,最終選擇laeA和mga2作為進一步研究對象。

表2 優化ANN模型預測的萘醌響應基因

Table 2 Naphthoquinone-responsive genes revealed by the optimized ANN model

2.3 萘醌添加發酵實驗驗證mga2基因是萘醌響應基因

為了驗證laeA和mga2這2個基因中哪個是萘醌響應基因,我們利用相應的基因敲除菌株進行萘醌添加發酵實驗。萘醌誘導條件下Δmga2菌株的萘醌響應顯著減弱,紅曲色素產率的誘導效果消失(圖3-a～圖3-c),說明缺乏mga2基因后紅曲菌株無法響應萘醌化合物。ΔlaeA菌株在萘醌化合物誘導條件下,依然保留了一定的誘導效果(圖3-d～圖3-f),說明laeA不是主要的響應基因。基因mga2是G蛋白中的β亞基,參與G蛋白信號轉導途徑,因此萘醌化合物可能激活質異三聚體G蛋白,mga2亞基則向下游傳導信號,促進紅曲色素合成過程[24]。

a-10 μmol/L萘醌誘導Δmga2菌株；b-30 μmol/L萘醌誘導Δmga2菌株；c-50 μmol/L萘醌誘導Δmga2菌株；d-10 μmol/L萘醌誘導ΔleaA菌株；e-30 μmol/L萘醌誘導ΔleaA菌株；f-50 μmol/L萘醌誘導ΔleaA菌株

圖3 萘醌添加實驗驗證mga2基因是萘醌響應基因

Fig.3 Identification of mga2 as the naphthoquinone-responsive gene by naphthoquinone feeding assay

2.4 萘醌誘導mga2基因過表達菌株提高紅曲色素產率

研究進一步利用mga2的過表達菌株M7::PtrpC-mga2實現萘醌介導的紅曲色素產率提高。該過表達菌株為實驗室前期構建,其紅曲色素產率為1 126 U/mg,與原始菌株M7沒有顯著差異。首先測定了不同種類萘醌化合物在30 μmol/L濃度下對菌株紅曲色素產率的影響,發現白花丹醌條件下紅曲色素產率最高,比對照組提高了52%,達到1 719 U/mg(圖4-a)。然后測定了不同濃度(0、10、20、30、40 μmol/L)白花丹醌的影響,結果表明,在20 μmol/L濃度下,過表達菌株的紅曲色素產率達到1 877 U/mg(圖4-b)。研究還測定了白花丹醌的添加時機,發現在菌株培養第3天加入20 μmol/L的白花丹醌,紅曲色素產率進一步提高到了2 002 U/mg(圖4-c)。同時,我們還測定了野生菌株M7和過表達菌株M7::PtrpC-mga2中mga2基因的轉錄表水平,發現過表達菌株中該基因的轉錄水平是野生菌株的4.2倍(圖4-d)。綜合以上結果說明提高mga2基因的表達量能夠增強紅曲菌對萘醌的響應能力。最后,研究還測定了紅曲色素發酵的過程曲線,可見白花丹醌誘導后紅曲色素產率顯著增加(圖4-e)。

a-不同萘醌對菌株M7::PtrpC-mga2紅曲色素產率的影響；b-不同濃度白花丹醌對菌株M7::PtrpC-mga2紅曲色素產率的影響；c-不同誘導時機對菌株M7::PtrpC-mga2紅曲色素產率的影響；d-原始菌株與M7::PtrpC-mga2菌株中mga2基因的相對表達水平；e-原始菌株與M7::PtrpC-mga2菌株發酵紅曲色素的過程曲線

圖4 白花丹醌誘導提高M7::PtrpC-mga2菌株的紅曲色素產率

Fig.4 Improvement of Monascus pigments yield in strain M7::PtrpC-mga2 by plumbagin induction

3 結論

本研究發現萘醌化合物能夠提高紅曲色素產率,然后通過轉錄組學和人工智能模型聯用的方法預測到可能的萘醌響應基因,利用基因工程菌株驗證后,成功用于提高紅曲色素產率。研究發現,G蛋白中的β亞基mga2是紅曲菌中的萘醌響應基因,利用該基因的過表達菌株,在白花丹醌誘導下紅曲色素產率顯著提高。本研究不僅率先發現紅曲菌中的萘醌響應基因,并應用于提高紅曲色素產率,也為其他真菌中相似研究提供了方法上的借鑒。