釀酒黃水對希瓦氏菌和假單胞菌抑菌機理的研究

黃水為棕黃色黏稠液體,由于其顏色棕黃故稱之為黃水或黃漿水[1]。濃香型白酒生產過程中,酶與酵母將酒醅中的淀粉轉化為酒精,同時生成CO2。該過程中微生物代謝的水分以及酒醅原有水分逐漸溶解酒醅中的有機酸、香味前體物等物質,最終沉積形成釀酒黃水。黃水中包括大量有機酸,其中乙酸、乳酸、丙酸、丁酸等含量較高。此外,黃水還含有酯、醇、醛等揮發性物質以及氨基酸等成分。目前,回窖、養窖以及人工窖泥是常規處理方式,但無法根本解決黃水的環境污染問題[2]。

新鮮魚類具有高水分和高蛋白的特點[3],在儲存和運輸過程中易發生微生物的腐敗,水產品中最常見的致腐菌包括希瓦氏菌、明亮發光桿菌、乳酸菌和假單胞菌。張雯等[3]從腐敗的大黃魚魚肉中分離得到希瓦氏菌和假單胞菌,確定海水魚的優勢腐敗菌為希瓦氏菌。郭全友等[4]研究也認為養殖大黃魚中的優勢腐敗菌為希瓦氏菌。此外,蘇紅等[5]與張新林等[6]研究發現紅鰭東方鲀與三文魚中的優勢腐敗菌為假單胞菌。綜上,在有氧冷藏條件下,希瓦氏菌為多數海洋魚類的優勢腐敗菌,假單胞菌為多數淡水魚類的優勢腐敗菌[7]。

鑒于此,本研究以希瓦氏菌和假單胞菌為研究對象,采用釀酒黃水作為生物保鮮劑,通過抑菌圈法、二倍稀釋法表征釀酒黃水對希瓦氏菌和假單胞菌生長的影響,同時測定2種致腐菌的生長曲線、菌體細胞膜的通透性、磷酸酶(alkline phosphatase,AKP)活性等指標,并輔以掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察黃水處理前后2種菌體的微觀形貌變化,來探索釀酒黃水對魚類主要致腐菌生長的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料設備與培養基

希瓦氏菌,天津大學贈予；假單胞菌(CICC 21620),中國工業微生物菌種保藏管理中心；釀酒黃水,貴州茅臺酒廠；酵母浸粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉,北京索萊寶生物有限公司；堿性磷酸酶試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司。

臺式掃描電鏡(Pro),飛納；AMR-100/100T酶標儀,奧盛儀器；XPS熒光酶標儀,Gemini。

LB培養基(g/L)：酵母浸粉5,胰蛋白胨10,氯化鈉10；固體培養基另外補充瓊脂粉20。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備菌懸液

斜面菌種接種于5 mL的LB液體培養基中,30 ℃培養24 h,以2%接種量接種后二次培養8 h,7 000 r/min離心5 min,棄上清液,菌泥稀釋至1×106 CFU/mL,備用。

1.2.2 抑菌圈的測定

參照SHARMA等[8]的方法并稍作修改。菌懸液以1‰的接種量接種至55 ℃的半固體培養基中,混勻,倒入牛津杯中,待半固體凝固后,拔出牛津杯,每小孔加入5 μL相應的液體,30 ℃培養24 h,游標卡尺測量抑菌圈直徑,實驗重復3次。

1.2.3 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測定

參照AL-ADHAM等[9]的方法并稍作修改。采用試管二倍梯度稀釋法：每次試驗使用9支試管,每支試管中先加入5.0 mL的LB液體培養基,121 ℃滅菌20 min,編號1～9。8號為陽性CK,只加菌液,9為陰性CK,只加釀酒黃水。1～7號試管,其中1號加入5 mL釀酒黃水,混勻后取5 mL加入2號試管,以此類推按1∶2至1∶128稀釋,為使終液量都等于5 mL,7號和9號試管均棄5.0 mL培養基。1～8號試管按照2%的接種量接種,9號接種2%滅菌生理鹽水,將希瓦氏菌和假單胞菌都放在30 ℃的恒溫培養箱中培養24 h,觀察結果。當陽性CK出現渾濁,而陰性CK呈現透明,實驗結果有效,觀察處理組的澄清情況,并進行記錄。

1.2.4 致腐菌生長曲線的測定

參照楊昆等[10]的研究方法并稍作修改。處理組加入釀酒黃水并使其終濃度為MIC,37 ℃培養24 h,酶標儀測定OD600 nm值,前12 h每隔2 h 測定1次,之后12 h測定1次,實驗重復3次,以培養時間為橫坐標,OD600 nm的平均值為縱坐標,繪制生長曲線。

1.2.5 致腐菌核酸含量的測定

即4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),能夠與核酸結合發出熒光,且與核酸量呈正比。因此,使用熒光酶標儀可測得胞內和胞外核酸總量[11]。

參照繆玉佳等[12]的研究方法。按照2%的接種量,將2 mL培養至對數期的菌離心處理(4 500 r/min,15 min),并用無菌水洗滌3次。用相應MIC濃度的黃水稀釋致腐菌,30 ℃培養。取培養0、3、6、9、12、24 h的菌液各0.5 mL,加入等體積DAPI染色液,振蕩培育10 min,用熒光酶標儀在DNA(364 nm)和RNA(400 nm)的激發波長下分別測定熒光強度,實驗重復3次,以無菌水懸浮的菌體作為CK組。

1.2.6 致腐菌紫外吸收物質的測定

參照AL-ADHAM等[9]的研究方法并稍作修改。按照2%的接種量,將生長對數期的菌離心處理(4 500 r/min,15 min),并用無菌水洗滌3次。處理組：用相應MIC的黃水稀釋致腐菌；陽性CK組：用等體積無菌水把菌體混勻,并加入Triton×100破裂菌體。陰性CK組：用等體積無菌水把菌體混勻。3組均30 ℃培養,分別于0、5 h取上清液,酶標儀測定。

1.2.7 致腐菌AKP酶活力的測定

洗滌對數期菌體,分別用離心前等體積的0.5MIC、1MIC、2MIC的黃水混勻菌泥,30 ℃培養,間隔4 h取樣,4 500 r/min離心10 min,棄菌泥,留上清液,以試劑盒檢測AKP酶活力。

1.2.8 致腐菌形態的觀察

參照趙麗[13]的方法并稍作修改。向處于對數期的菌液加入MIC的釀酒黃水,充分混勻,培養6 h。取2 mL菌懸液,8 000 r/min,4 ℃離心5 min,棄上清液,用無菌水漂洗2次,離心收集菌泥,使用臺式掃描電子顯微鏡觀察用釀酒黃水處理過的菌體的微觀結構。

1.3 統計學處理

實驗重復3次,用SPSS統計軟件進行數據分析,結果以(x±s)表示,實驗數據采用單因素方差分析和t檢驗,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 釀酒黃水對2種致腐菌抑菌圈直徑的影響

釀酒黃水對希瓦氏菌和假單胞菌都具有一定的抑制作用,對希瓦氏菌的抑菌圈為(16.44±0.61)mm,對假單胞菌的抑菌圈直徑為(17.86±0.98)mm,說明黃水對于2個菌株均有較明顯抑制生長的作用,后續實驗可以繼續開展。

2.2 釀酒黃水對2種致腐菌MIC的影響

由表1可看出,對于海水魚主要致腐菌希瓦氏菌而言,在5號對應的體積分數3.13%條件下,菌株無法生長,但在6號對應體積分數1.56%的條件下,菌株即可導致培養基混濁,因此黃水對希瓦氏菌的最低抑菌濃度為3.13%。同理,假單胞菌的最低抑菌濃度是1.56%。后文以MIC代表2個致腐菌的最低抑菌濃度。

表1 黃水對希瓦氏菌和假單胞菌的MIC

Table 1 Minimum inhibitory concentration of yellow water against Shewanella and Pseudomonas

注：“+”代表渾濁；“-”代表澄清;數字1～7分別代表50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%的黃水濃度；8代表陽性CK,僅加菌液；9代表陰性CK,僅加釀酒黃水

2.3 釀酒黃水對致腐菌生長曲線的影響

由圖1-a可知,希瓦氏菌CK組8 h進入穩定期,前8 h的OD均值可達0.056 OD/h,第8 h OD值為0.47,0.5MIC處理時,前8 h的OD均值僅為 0.028 OD/h,第8 h OD值為0.23,低于CK組正常生長希瓦氏菌48.9%。相對而言,當希瓦氏菌處于1MIC和2MIC黃水環境下,生物量不增加,說明3.13%的黃水濃度可以有效抑制希瓦氏菌的生長。

由圖1-b可知,假單胞菌CK組也在8 h左右進入穩定期,前8 h的OD均值為0.056 OD/h,第8 h為0.47,然而在0.5MIC黃水處理時,前8 h的OD均值為0.011 OD/h,第8 h為0.09,僅達到CK組的19.1%,說明1.56%的黃水濃度可以有效抑制假單胞菌的生長。

a-希瓦氏菌；b-假單胞菌

圖1 釀酒黃水對生長曲線的影響

Fig.1 Effect of yellow water on the growth curve

2.4 釀酒黃水對致腐菌核酸含量的影響

由圖2-a可知,希瓦氏菌CK組的DNA、RNA在8 h熒光強度最高,之后下降,這和圖1-a的生長曲線相吻合,即生長曲線在8 h到達穩定期之后開始衰減,但是處理組DNA和RNA的熒光強度在6 h達到頂峰之后迅速衰減,DNA最大值55.3 RFU,僅是CK組最高值的64.9%。此外,處理組的DNA平均熒光強度為42.8 RFU,僅為CK組平均熒光強度的58.8%；RNA平均熒光強度僅為CK組的69.9%。

由圖2-b可知,假單胞菌CK組DNA和RNA熒光強度最高值出現在12 h(分別為97.3 RFU與209.3 RFU)。相比之下,處理組DNA含量在第12 h僅有59.4 RFU,是CK組的61%,處理組的RNA含量在12 h僅有125.1 RFU,是CK組的59.7%。同時,處理組的DNA平均熒光強度為50.7 RFU,僅為CK組的61.5%,RNA平均熒光強度僅為CK組的54.5%。

a-希瓦氏菌；b-假單胞菌

圖2 釀酒黃水對DNA和RNA含量的影響

Fig.2 Effect of yellow water on synthesis of DNA and RNA

可見,黃水對于希瓦氏菌和假單胞菌的生長起到了非常明顯的抑制作用,且與菌體剛接觸時便能夠起效。雷燕等[14]認為小分子的有機酸可以透過致腐菌的細胞壁,進入其細胞內解離出H+,H+能干擾細菌DNA和RNA的合成[15-16],從而抑制致腐菌的生長。研究發現黃水中酸的質量濃度可達19.64 g/L,因此處理組的核酸合成速度驟降可能與黃水中酸類物質解離出H+影響其合成有關。

2.5 釀酒黃水對致腐菌紫外吸收物質的影響

由圖3可見,在使用Triton×100完全破碎菌體的陽性CK組中,希瓦氏菌的蛋白質及核酸的量,在0 h分別為1.06 mg/mL、90.7 μg/mL,在5 h分別達到1.02 mg/mL、92.4 μg/mL；陰性CK組中,希瓦氏菌的蛋白質及核酸的量,0 h分別為0.02 mg/mL與4.7 μg/mL,5 h分別為0.04 mg/mL與7.6 μg/mL。值得注意的是,1MIC黃水處理組,0 h時希瓦氏菌的蛋白含量是陰性CK組的3.33倍,隨著處理時間延長,5 h時提高到21.5倍。與此相似,1MIC黃水處理組,0 h時希瓦氏菌核酸含量為陰性CK的4.57倍,處理時間延長至5 h,該數值增長到8.19倍。可見隨著時間的延長,1MIC黃水處理組核酸與蛋白釋放量均顯著提高,證明黃水對于細胞膜具有破壞性的作用。

a-核酸；b-蛋白質

圖3 釀酒黃水對希瓦氏菌核酸和蛋白質含量的影響

Fig.3 Effect of yellow water on the content of Shewanella

注：不同字母表示實驗組間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

同樣,由圖4可見,在陽性CK組中,假單胞菌的蛋白質及核酸的量,在0 h分別為1.21 mg/mL與89.9 μg/mL,5 h時可達到1.22 mg/mL與90.9 μg/mL；在不經過黃水和Triton×100處理的陰性CK組中,假單胞菌的蛋白質及核酸含量,在0 h分別為0.05 mg/mL、5.61 μg/mL,5 h分別達到0.05 mg/mL、4.94 μg/mL。值得注意的是,起始階段,處理組與陰性CK組的蛋白質釋放量比值為18.8∶1,處理5 h后為24.2∶1；盡管比值提高,但提升幅度并沒有希瓦氏菌明顯。對于核酸而言,1MIC處理組與陰性CK組相比,在0 h倍數差能達到11.7倍,處理5 h后倍數差為15.2倍,可見黃水對于假單胞菌細胞膜的影響起速快且更為明顯,并且效果穩定度較好。

a-核酸；b-蛋白質

圖4 釀酒黃水對假單胞菌核酸和蛋白質含量的影響

Fig.4 Effect of yellow water on the content of Pseudomonas

盛杰等[17]研究發現,釀酒黃水會通過抑制芽胞桿菌核酸與蛋白的合成,從而達到抑制其生長。BAJPAI 等[18]的研究表明,核酸和蛋白是細胞內重要的大分子物質,正常狀態下不能透過細胞膜,但是當菌體細胞膜通透性增加時,會從細胞內泄露,因為在260 nm處核酸[19-21]有強吸收,因此可檢測菌懸液的OD值來反應核酸含量的變化,可得到細胞膜是否完整的結果。LONG等[22]的研究也表明,核酸、蛋白質等生物大分子是細胞的重要組成結構,大腸桿菌細胞膜被破壞時,核酸、蛋白質等大分子物質就會從細胞內泄露。周倩倩等[23]研究發現,抑菌物質丁香酚與希瓦氏菌和假單胞菌接觸后細胞膜通透性增加,使得核酸和蛋白質從細胞內泄露。這些現象與本研究結果相符。

2.6 釀酒黃水對致腐菌細胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶存在于細胞壁、細胞膜之間,當細胞壁或膜破壞后,堿性磷酸酶會泄露。如果檢測到胞外堿性磷酸酶活性上升,就反應了該細胞壁通透性增加。為了進一步探究黃水對于2種魚類致腐菌可能的損傷機理,測定了2種致腐菌的AKP活性。由圖5-a可見,CK組的希瓦氏菌8 h進入穩定期之后,由于菌體死亡量增大,AKP的酶活性上升速度加快,0.5MIC處理組與CK組相似。但在1MIC和2MIC處理條件下,2組AKP的酶活力隨時間延長上升速度加快,平均可達8.11及8.59 mmol/(L·h)且加快速度及最終酶活力與黃水濃度呈正比,其中2MIC處理組中,希瓦氏菌的AKP酶活力在12 h內由34.4 mmol/L上升了3.9倍,達到了137.5 mmol/L,顯著高于CK組的100.6 mmol/L(P<0.05)。

由圖5-b可見,對假單胞菌8 h進入穩定期之后,AKP的酶活力同樣上升速度加快。12 h時,0.5MIC處理組比CK組的酶活力高1.35倍,1MIC處理組比CK組的酶活力高1.53倍,2MIC處理組比CK組的酶活力高1.94倍。可知最終的AKP活力與釀酒黃水的濃度呈正比。這些結果表明細胞壁的通透性顯著增加,意味著細菌細胞壁的完整性已被破壞。細胞壁具有固定細胞形態、提高細胞機械強度、避免滲透壓等外力對細胞造成損傷的能力,失去細胞壁的保護,細菌很快就會死亡。因此,釀酒黃水能夠通過破壞細菌細胞壁來提高其抗菌活性。HSOUNA等[24]認為酸類物質會導致細胞壁中脂多糖[25]的降解,導致細胞壁的外膜結構被破壞。經檢測黃水中含有大量有機酸,因此推測有機酸會作用于2種致腐菌的細胞壁,導致其破損,從而使胞外AKP活力上升。

a-希瓦氏菌；b-假單胞菌

圖5 釀酒黃水對AKP活力的影響

Fig.5 Effects of yellow water on AKP activity

2.7 釀酒黃水對致腐菌形貌的影響

圖6與圖7為黃水處理前后希瓦氏菌和假單胞菌電鏡圖。由圖6-a與圖7-a可見,正常的希瓦氏菌和假單胞菌大小為0.2～0.3 μm,桿狀,個體獨立,表面光滑、均勻。處理組經MIC黃水處理后希瓦氏菌和假單胞菌(圖6-b與圖7-b)表面出現凹凸不平,有的甚至出現凹陷與空洞,說明MIC濃度的黃水影響了希瓦氏菌和假單胞菌的細胞膜完整性,這一現象解釋了AKP酶活力的實驗結果。

a-正常形態菌；b-釀酒黃水1MIC處理

圖6 希瓦氏菌電鏡圖

Fig.6 SEM images of Shewanella

a-正常形態菌；b-釀酒黃水1MIC處理

圖7 假單胞菌電鏡圖

Fig.7 SEM images of Pseudomonas

HSOUNA等[24]認為酸類物質會導致革蘭氏陰性菌細胞壁中脂多糖的降解,破壞細胞壁中的外膜結構。經檢測黃水中含有豐富的有機酸,因此2個致腐菌在黃水的處理下呈現出細胞壁凹陷的現象很可能與此原因有關。

3 結論

3.13%與1.56%的釀酒黃水可以有效抑制希瓦氏菌與假單胞菌的生長。釀酒黃水破壞希瓦氏菌與假單胞菌的細胞膜透性與完整性,導致胞內蛋白質與核酸泄露,AKP活力上升,影響細菌正常的代謝過程,最終使菌體死亡。前期實驗發現,釀酒黃水中所含的乳酸、庚酸、己酸、戊酸、檸檬酸等成分能夠明顯影響希瓦氏菌和假單胞菌生物量的增長,因此推測酸類物質為釀酒黃水的有效抑菌成分,本實驗結果為釀酒黃水用于魚類保鮮做了初步的理論鋪墊。