低聚糖對益生菌發酵乳功能特性的影響

益生菌是對宿主有益的活的微生物,其可以降低血清膽固醇、改善腸道健康、預防各種癌癥、促進免疫反應和改善認知障礙[1-3]。益生菌通過黏附腸上皮細胞在腸道定植從而抑制腸道有害菌,改善腸道微生態平衡,進而改善胃腸道的生理平衡,以此對宿主產生有益作用[4]。乳酸菌的抗氧化等重要生物學功能在保障食品質量、提高食品品質方面具有重要作用[5-8]。發酵乳是益生菌最好的載體,功能性益生菌發酵乳的研究開發一直受到廣泛關注[9]。

功能性低聚糖是由3～10個單位的不同聚合程度的單體組成的簡單碳水化合物和可溶性膳食纖維[10]。菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖是被廣泛應用于食品工業中的功能性低聚糖[11-12]。低聚糖對益生菌的生長具有增殖作用,楊健等[13]研究了4種低聚糖對乳酸菌體外增殖過程的影響,發現低聚果糖對干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖效果最好。李雅麗等[14]研究了6種低聚糖對腸道益生菌生長情況以及代謝產物的影響,發現其對各益生菌的促生長和促產酸能力不同,以水蘇糖和低聚半乳糖的效果最為顯著。但低聚糖對益生菌發酵乳功能特性的影響研究鮮有報道。

為了凸顯益生元發酵乳的益生性,應該和含有益生菌的發酵乳結合,從而構建益生元、益生菌、發酵乳三者的協同關系[15]。本文選取菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖與實驗室篩選得到的具有優良功能特性的3株益生菌進行合生元組合實驗,制備合生元發酵乳,探究低聚糖對益生菌發酵乳活菌數、pH、酸度、總抗氧化能力和黏附能力的影響,并對其進行相關性分析,旨在探討不同低聚糖對益生菌發酵乳功能特性的影響及其之間的相關性,為功能性合生元發酵乳的開發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

試驗菌株：鼠李糖乳桿菌LV108、鼠李糖乳桿菌 Hsryfm 1301、發酵乳桿菌DALI 02,揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室保藏。

原料：全脂乳粉、脫脂乳粉,新西蘭威士蘭乳業公司；菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、蔗糖,上海昊岳食品科技有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸,均為色譜純,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；MEM培養液、MEM非必需氨基酸溶液、丙酮酸鈉溶液、GlutaMAX谷氨酰胺添加劑,美國Gibco公司;0.25%胰酶細胞消化液、PBS,上海碧云天生物技術公司。

培養基：MRS培養基：液體用于菌種的活化,固體用于活菌計數；益生元選擇培養基：分別用菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖替換MRS中的葡萄糖,121 ℃,15 min滅菌冷卻后備用,用于菌株生長曲線的測定；益生元增殖培養基：120 g/L全脂乳粉,60 g/L蔗糖復配過篩均質后分別添加20 g/L菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖,105 ℃,5 min 滅菌冷卻后備用,用于菌株增殖及功能測定；MEM培養基：77%(體積分數,下同)MEM、20% 優質胎牛血清、1% MEM非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸鈉溶液、1% GlutaMAX谷氨酰胺添加劑,4 ℃貯藏備用,用于Caco-2細胞的傳代培養。

1.1.2 實驗設備

JF-SX-500全自動滅菌鍋,日本TOMYG公司；超凈工作臺SW-CJ-1F,蘇州凈化設備有限公司；高壓均質機GYB 60-08,上海東華高壓均質機廠；7890 A-7697 A氣相色譜儀,美國Agilent公司；5804 R型高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司；生長曲線測定儀,Bioscreen C；CO2細胞培養箱,美國賽默飛世爾科技有限公司；細胞計數儀IC 1000,上海睿鈺生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 益生菌生長曲線的測定

分別以菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖作為單一碳源代替MRS培養基中的葡萄糖。將實驗菌株以3%接種量分別接種3種不同低聚糖為碳源的培養基中在自動生長曲線儀中37 ℃培養48 h。以菌液的OD600值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.2 益生菌發酵乳的制備

復配乳經標準化后,60 g/L的蔗糖分別添加20 g/L的低聚糖(菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖),經均質、熱處理后冷卻,單菌發酵乳按3%的接菌量分別接入3株益生菌,37 ℃發酵18 h。

1.2.3 發酵乳活菌數的測定

將發酵乳搖晃均勻后進行梯度稀釋。采用MRS固體培養基傾注法,37 ℃培養48 h,對發酵乳中的活菌進行計數。

1.2.4 發酵乳pH的測定

使用玻璃電極pH計測定樣品的pH值。

1.2.5 發酵乳酸度的測定

稱取5 g左右發酵乳樣品,記錄質量m,用40 mL蒸餾水稀釋,并加酚酞指示劑,用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色,并在30 s內不變色,記錄體積V,按公式(1)計算樣品酸度(°T)：

酸度

(1)

1.2.6 發酵乳總抗氧化能力的測定

樣品總抗氧化能力按照T-AOC試劑盒說明書進行測定。稱取27.8 mg試劑盒中的FeSO4·7H2O,用去離子水溶解并定容至1 mL,此時濃度即為100 mmol/L。用去離子水將100 mmol/L FeSO4·7H2O分別稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L的標準品溶液。取5 μL不同濃度的標準品溶液加入96孔板中,在孔中加180 μL FRAP工作液,37 ℃孵育3～5 min后,用酶標儀測定波長為593 nm處的OD值,繪制標準曲線,得到曲線公式。分別取5 μL稀釋后的發酵乳加入96孔板中,在孔中加180 μL 光脫色熒光恢復技術(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)工作液,37 ℃孵育3～5 min后,用酶標儀測定波長為593 nm處的OD值,將樣品的OD值代入總抗氧化標準曲線,求得結果。

1.2.7 益生菌在Caco-2細胞上的黏附

1.2.7.1 Caco-2細胞的培養

將Caco-2細胞接種于MEM培養基中并置于恒溫培養箱(37 ℃,5% CO2,相對濕度90%)中培養。每兩天更換一次培養液,當Caco-2細胞長滿培養瓶底部80%時用含2.5 g/L的胰酶消化液消化后,進行傳代。穩定傳代至5代后可用于試驗。

1.2.7.2 發酵乳中益生菌在Caco-2細胞上黏附能力的測定

參照文獻[16]的方法并略作修改。在24孔細胞板上每孔加入1 mL發酵乳(pH經10 g/L NaOH溶液調節至7.0),37 ℃下在細胞培養箱里共孵育2小時。孵育結束后每孔用PBS重復清洗3次后加入0.15 mL胰酶消化液并放入細胞培養箱消化3 min左右。將細胞板置于顯微鏡觀察到貼壁細胞漂浮在消化液中時加入0.35 mL MEM培養基終止消化。按照1.2.3的方法計算黏附在Caco-2細胞上的益生菌數量。黏附率按公式(1)計算:

黏附率

(2)

式中：N0,發酵乳中原始益生菌活菌數；N1,黏附后益生菌活菌數。

1.3 統計學分析

實驗數據均平行測定3次,使用平均值±標準差表示,所有數據均采用Excel 2019、SPSS 25.0和Origin 2019進行統計分析與繪圖,各組均數比較采用Duncan法多重方差分析,P<0.05為顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 低聚糖對益生菌生長曲線的影響

以低聚糖作為單一碳源,測定不同益生菌的生長情況。由圖1-a可知,LV108利用低聚果糖的生長促進效果最為明顯,低聚半乳糖、菊粉次之。由圖1-b可知,Hsryfm 1301在利用低聚糖生長時對低聚半乳糖顯示出較好的嗜好性,顯著高于菊粉和低聚果糖。由圖1-c可知,DALI 02利用3種低聚糖生長情況排序為低聚果糖>菊粉>低聚半乳糖,在利用低聚果糖時OD600可達到1.4左右,高于菊粉和低聚半乳糖且接近葡萄糖組的生長情況。

a-菌株 LV108；b-菌株 Hsryfm 1301；c-菌株 DALI 02

圖1 益生菌利用低聚糖生長情況

Fig.1 Growth of probiotics using oligosaccharides

2.2 低聚糖對益生菌發酵乳活菌數的影響

在全脂牛乳中添加2%不同低聚糖制備益生菌發酵乳,發酵結束后進行活菌數測定。由圖2可知,菊粉和低聚果糖對LV108發酵乳的活菌數增殖作用不顯著(P>0.05),低聚半乳糖對LV108發酵乳活菌數增殖作用顯著(P<0.05),活菌數由8.37×108增殖至9.13×108 CFU/mL。

LV108、Hsryfm 1301、DALI 02,分別表示使用3株菌發酵的發酵乳；I、F、G分別表示菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖(下同)

圖2 低聚糖對益生菌發酵乳活菌數的影響

Fig.2 Effect of oligosaccharides on the number of viable bacteria in probiotic fermented milk

注：不同的字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)

低聚糖對Hsryfm 1301發酵乳的活菌數增殖效果排序為菊粉>低聚半乳糖>低聚果糖(P<0.05),菊粉和低聚果糖對DALI 02 發酵乳活菌數增殖效果接近且與其他組別差異顯著(P<0.05)。LV108和Hsryfm 1301發酵乳活菌數顯著高于DALI 02發酵乳(P<0.05),均在8×108 CFU/mL左右。3種低聚糖對Hsryfm 1301發酵乳中活菌數具有較好的增殖效果,其中菊粉對Hsryfm 1301發酵乳中活菌數增殖幅度最大,由8.17×108至1.24×109 CFU/mL,為空白組的1.52倍,顯著高于其他低聚糖發酵乳。

2.3 低聚糖對益生菌發酵乳pH和酸度的影響

由圖3可知,低聚半乳糖對3株益生菌發酵乳pH降低作用均不顯著(P>0.05)。

圖3 低聚糖對益生菌發酵乳pH的影響

Fig.3 Effect of oligosaccharides on the pH of probiotic fermented milk

菊粉和低聚果糖均顯著降低了LV108和DALI 02發酵乳的pH(P<0.05),其中菊粉對LV108發酵乳pH的降低效果最為明顯,由4.84降至4.55,降低幅度為5.99%。菊粉和低聚果糖對Hsryfm 1301發酵乳pH的影響不顯著(P>0.05),添加低聚半乳糖后Hsryfm 1301發酵乳的pH得到了提高,由4.45增至4.56,提高幅度為2.47%。

由圖4可知,3種低聚糖均顯著提高了LV108和DALI 02發酵乳的酸度(P<0.05),其中菊粉對LV108和DALI 02發酵乳酸度的提升最為顯著,分別由72.12、63.54提升至85.66、71.86°T,提高幅度分別為18.69%、13.09%。添加菊粉和低聚果糖對Hsryfm 1301發酵乳酸度沒有顯著影響(P>0.05),而添加低聚半乳糖組的酸度得到了顯著降低(P<0.05),由79.77降至77.50°T。

圖4 低聚糖對益生菌發酵乳酸度的影響

Fig.3 Effect of oligosaccharides on the pH of probiotic fermented milk

2.4 低聚糖對益生菌發酵乳總抗氧化能力的影響

利用試劑盒對發酵乳進行總抗氧化能力測定。由圖5可知,添加低聚果糖的LV108發酵乳總抗氧化能力為4.17 mmol/g prot,顯著高于添加菊粉和低聚半乳糖組(P<0.05),為空白組的1.83倍。菊粉和低聚果糖對Hsryfm 1301發酵乳總抗氧化能力的增效作用顯著優于低聚半乳糖(P<0.05)。對于DALI 02而言,3種添加低聚糖組之間的總抗氧化能力差異不顯著且較之空白組均有1.5倍左右的提升,為4 mmol/g prot 左右。3種低聚糖對3株益生菌發酵乳在總抗氧化能力上表現出廣譜的增強,未添加低聚糖組中Hsryfm 1301發酵乳總抗氧化能力最強,為4.01 mmol/g prot。添加菊粉的Hsryfm 1301發酵乳總抗氧化能力在所有添加低聚糖組別中最強,為4.85 mmol/g prot。

圖5 低聚糖對益生菌發酵乳總抗氧化能力的影響

Fig.5 Effect of oligosaccharides on the total antioxidant capacity of probiotic fermented milk

2.5 低聚糖對發酵乳中益生菌對Caco-2細胞黏附的影響

在Caco-2細胞傳代穩定后進行發酵乳中益生菌的黏附能力測定。由圖6可知,添加菊粉和低聚半乳糖對LV108的黏附能力沒有顯著提升(P<0.05),LV108利用低聚果糖使其黏附率從0.56%提升至0.89%。Hsryfm 1301利用3種低聚糖對黏附能力的提升程度相當,均提升0.5倍左右。菊粉和低聚果糖對于DALI 02黏附的改善較大,其黏附率分別提升了0.98、0.66倍,低聚半乳糖對黏附能力沒有改善。低聚果糖對發酵乳中3株益生菌黏附Caco-2能力具有廣譜的提升作用,發酵乳中LV108和DALI 02黏附Caco-2能力在添加低聚半乳糖后沒有顯著變化(P<0.05)。

圖6 低聚糖對益生菌發酵乳黏附Caco-2細胞的影響

Fig.6 Effect of oligosaccharides on adhesion of probiotic fermented milk to Caco-2 cells

2.6 相關性分析

對本文所測指標進行相關性分析,皮爾遜相關性分析結果如表1所示。總抗氧化能力與活菌數呈正相關(P<0.05),與pH呈負相關(P<0.05)。黏附Caco-2細胞能力與活菌數呈負相關(P<0.01),與pH呈正相關(P<0.01),與酸度呈負相關(P<0.05)。

表1 發酵乳功能特性之間的相關性研究

Table 1 Correlation analysis of the functional properties of fermented milk

注：*在 0.05 級別,相關性顯著,**在 0.01 級別,相關性顯著

3 結論與討論

本文研究探討了不同低聚糖作為單一碳源測定益生菌對其的利用情況,并對不同低聚糖對益生菌發酵乳的活菌數增殖、總抗氧化能力、抑菌能力、Caco-2細胞黏附能力進行了探究。

3株益生菌在低聚糖條件下的生長效果均低于在葡萄糖條件下的生長情況,這可能是由于葡萄糖是一種單糖,更適合益生菌的生長[17]。益生菌在利用低聚糖生長時會表現出差異性,主要的原因是益生菌代謝低聚糖的酶系統存在差異[18-19]。3種低聚糖對Hsryfm 1301和DALI 02發酵乳中活菌數具有較好的增殖效果,其中菊粉對Hsryfm 1301發酵乳中活菌數的增殖幅度最大,由8.17×108至1.24×109 CFU/mL,為空白組的1.52倍。

3種低聚糖對3株益生菌發酵乳在總抗氧化能力上表現出廣譜的增強,益生菌的抗氧化作用在維持微生態平衡中發揮重要作用。研究發現,益生元和益生菌的協同混合對健康有積極的影響[20]。CERIELLO等[21]報道了一系列的糖尿病、發病機制和其他后續并發癥是由氧化應激和炎癥引起的,開發具有抗氧化能力的功能型食品對于治療此類疾病是一種良好的策略。發酵乳的抗氧化能力與益生菌在發酵牛奶過程中釋放的抗氧化肽密切相關[22],低聚糖協同益生菌可能在發酵牛奶過程中增強了抗氧化肽的釋放。

低聚果糖對發酵乳中3株益生菌黏附Caco-2能力均具有提升作用,發酵乳中LV108和DALI 02黏附Caco-2能力在添加低聚半乳糖后沒有顯著變化(P>0.05)。作為益生元的寡糖也可以增強益生菌菌株的黏附能力,這表明開發新的共生產品可能是一種潛在的工具,以增加益生菌在腸道中的停留時間[23]。CAO等[17]研究發現當植物乳桿菌ATCC 14917與不同寡糖一起培養時黏附特性發生了變化,甘露寡糖培養下其黏附能力顯著高于其他各組。甘露寡糖通過高表達黏附因子基因和多種乳酸菌表面蛋白來影響黏附特性[17]。

相關性分析結果顯示,總抗氧化能力與活菌數呈正相關(P<0.05),與pH呈負相關(P<0.05)。黏附Caco-2細胞能力與活菌數呈負相關(P<0.01),與pH呈正相關(P<0.01),與酸度呈負相關(P<0.05)。本文探究了不同低聚糖對益生菌發酵乳功能特性的影響,為篩選出合適的低聚糖作為益生元提供理論依據,對合生元的篩選及具有特定功能的合生元發酵乳的開發具有指導意義。